为大家分享一篇发表在nature communications上的文章，文章题目为“Metabolic glycan labeling immobilizes dendritic cell membrane and enhances antitumor efficacy of dendritic cell vaccine”。其通讯作者是来自伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的Wang Hua教授。

树突状细胞(DC)疫苗是FDA批准的首批癌症免疫疗法之一，但受到细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应和治疗效果的限制。在这里，作者报道了一种简单的代谢标记方法，可以靶向调节DC，以开发增强型DC疫苗。作者发现代谢聚糖标记可以降低DC的膜迁移率，从而激活DC细胞，改善DC的抗原呈递和随后的T细胞启动特性。代谢聚糖标记（MGL）本身可以增强DC疫苗的抗肿瘤效果，此外，通过MGL引入的细胞表面化学标签(如叠氮基团)也可以使细胞因子在体内结合到过继转移的DC上，从而进一步增强CTL反应和抗肿瘤功效。

作者首先合成Ac₄ManNAz，一种常用的非天然糖（图2a）。通过MGL将Ac₄ManNAz代谢到细胞膜表面，使BMDCs标记上azido基团，接着作者用FACS证明Ac₄ManNAz对BMDCs的代谢具有浓度依赖性（图2c），并且用Ac₄ManNAz处理的BMDCs的CD86、MHCII、CD40和CCR7的表达显著上调（图2d），这是DC的激活标志（图2e、f）。为了进一步了解azido标记的亚群是否比非标记的亚群CD86和MHCII的表达增加，BMDCs用Ac₄ManNAz处理，然后用DBCO-Cy5和CD86-FITC或MHCII-FITC抗体进行染色（图2g），结果证实了azido标签和CD86/MHCII之间的正相关性。为了了解azido标签是否在DC刺激中发挥作用，作者加入了其他非天然糖进行比较，结果发现这些非天然糖的处理都导致CD86和MHCII在DC上的表达上调。为了更好地理解激活标记上调背后的机制，作者对Ac₄ManNAz和PBS处理的DC进行了转录组分析。结果显示，Ac₄ManNAz治疗导致DCs的广泛转录变化（图2j）。

考虑到Ac₄ManNAz最终以糖蛋白和糖的形式在细胞膜上表达，众所周知，糖蛋白和糖脂在定义细胞膜的结构和特性方面发挥着关键作用，作者想知道MGL过程是否会导致膜流动性等膜特性的变化，这是DC激活状态增加的潜在机制。因此作者通过表达带有荧光蛋白的细胞膜蛋白，进行荧光漂白恢复（FRAP）实验分析荧光恢复的情况，以分析膜流动性。FRAP分析结果表明，与对照DC相比，用Ac₄ManNAz或ManNAc处理的DC显示膜的移动分数下降（图2k、l）。接着作者继续用FRAP实验证明了azido标记和膜流动性降低的相关性。

鉴于叠氮糖处理后DC的激活状态增强，作者将进一步研究MGL的DC是否表现出抗原处理和提呈的改善。作者通过模式肽抗原SIINFEKL进行表征。作者用SIINFEKL刺激BMDCs，结果发现与未经处理的DC相比，在Ac₄ManNAz处理的DC上检测到MHCI-SIINFEKL复合物水平显著增加（图3a，b），这表明azido标记DC的抗原呈现能力有所提高。与上述激活结果一致，在SIINFEKL肽存在的情况下，用Ac₄ManNAz处理的DC与对照DC相比，CD86和MHCII的含量要高得多（图3c，d）。接下来，作者研究了MGL的DC是否比未标记的DC更好地加工和呈递蛋白抗原(如卵清蛋白(OVA))。作者用OVA蛋白(200 nM或1 µM)与DC共孵育，结果显示，Ac₄ManNAz处理的DCs表达的MHCI-SIINFEKL复合物水平均显著高于对照DCs(图3g)。为了进一步验证azido标记的DC改善抗原呈递，作者将BMDCs将呈递SIINFEKL的DC与CFSE染色的OT-1细胞共培养，后者可以特异性识别MHCI-SIINFEKL复合物。正如预期的那样，与对照组相比，Ac₄ManNAz处理的DC显著改善了OT-1细胞的增殖(图3e, f)。这些实验表明，MGL可以改善DC的激活状态，改善DC对肽和蛋白抗原的加工和提呈，以及随后在体外引发抗原特异性CD8+ T细胞。

Fig.3 代谢聚糖标记改善了DC的激活状态、抗原递呈能力和随后的T细胞启动特性

接下来，作者想探究叠氮标记的DC与抗原是否会在体内表现出更好的抗原特异性CTL反应(图4a)。作者将MGL和SIINFEKL肽处理的BMDCs注射到C57BL/6小鼠体内。在注射DC疫苗后10或20天，收集外周血单个核细胞(PBMCs)用于分析SIINFEKL特异性CD8+细胞，结果显示DC疫苗组的SIINFEKL特异性CD8+细胞水平均有所升高(图4b, c)。作者将E.G7-OVA肿瘤皮下接种于小鼠侧腹，接种叠氮处理的DC疫苗的小鼠肿瘤生长明显减慢，动物存活时间延长(图4d-h)。这些实验表明，用Ac₄ManNAz对DCs的简单处理在体外制造步骤中，可以提高DC疫苗的CTL反应和抗肿瘤功效。

Fig.4 代谢聚糖标记改善了DC的激活状态、抗原递呈能力和随后的T细胞启动特性

除了DC激活效果外，azido标记还可以通过高效的点击化学将含有DBCO的免疫调节剂靶向DCs结合，这有可能进一步提高DC疫苗的抗原特异性CTL反应和整体抗肿瘤功效（图5a）。作者首先研究了azido标记的DCs是否可以共价结合DBCO修饰的IL-2和IL-15，这两种具有代表性的T细胞刺激细胞因子。作者通过实验证明DBCO/Cy5-IL-2可以通过高效的点击化学成功结合到azido标记的DC上。接下来，作者研究了IL-2或IL-15在DC上的偶联是否可以改善抗原特异性CD8+ T细胞的启动。结果显示，与DBCO-IL-15、DBCO-IL-2结合的azido标记DCs显著增强了OT-1细胞的增殖（图5f、g）。为了评估细胞因子偶联DC的潜在脱靶T细胞激活效应，作者还将IL-15偶联DC与CFSE染色的OT-1细胞和violet染色的非特异性CD8+T细胞共培养，结果显示，OT-1细胞的增殖率明显高于非特异性CD8+ T细胞（图5h-j）。为了检查T细胞刺激细胞因子在DCs上的表面偶联是否会诱导T细胞的耗尽，作者分析了OT-1细胞上抑制受体（例如PD-1、CTLA-4和LAG-3）的表达水平。结果显示，DC表面的细胞因子偶联没有改变OT-1细胞PD-1、CTLA-4和LAG-3的表面表达（图5k-n）。

接着作者上述这种方式应用到动物体内，作者首先证明了DBCO-Cy5在体内能够成功结合到azido标记的DC上，即体内可以发生此种点击化学反应。在演示了体内DC靶向效应后，作者接下来探讨了IL-15与DC的体内结合是否可以进一步提高CTL反应和抗肿瘤疗效。DC疫苗接种到小鼠后，发现DBCO-IL-15在体内与azido标记的SIINFEKL-表达DCs的结合可以改善SIINFEKL特异性CD8+ T细胞的扩增，azido标记的DC疫苗与DBCO-IL-15相结合，能够导致肿瘤生长较慢，动物存活时间延长（图6g-k）。这些结果表明，在体内将IL-15与DC结合，可以提高抗原特异性CD8+ T细胞反应和整体抗肿瘤疗效。

总之，作者报告了一种简便的MGL方法，用于开发增强型DC疫苗。叠氮糖可以将叠氮基团代谢到DC表面，其本身可以降低DC的膜迁移率，激活DC，提高DC的抗原呈递和T细胞启动能力。此外，叠氮标记的DC能够通过高效的体外和体内点击化学结合DBCO-细胞因子，包括IL-2和IL-15，从而提高CTL反应和抗肿瘤效果。这种方法可以普遍适用于不同类型的DC疫苗治疗各种类型的肿瘤。良好的安全性也增加了开发的DC疫苗的转化潜力。DC标记和靶向技术不仅能够开发出具有强大CTL反应和治疗效果的增强型DC疫苗，而且还为操纵DC与其他免疫细胞之间的细胞间相互作用提供了平台。

本文作者：CHY

原文引用：10.1038/s41467-023-40886-7

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