分享一篇发表在Science上的文章，通讯作者是来自荷兰代尔夫特工业大学Cees Dekker教授，他们组研究方向包括染色质结构、纳米孔设计等。

      在单分子水平上面进行蛋白质及其序列的检测技术能够促进蛋白质组学的研究，提供单细胞水平上低丰度蛋白及修饰的组成和量化信息。此前，生物纳米孔已经应用于单分子DNA检测中，通过使用DNA易位运动的酶让DNA缓慢通过纳米孔、并根据产生的离子电流来解析DNA序列。而在蛋白检测方面，也有一些类似方法尝试在单分子水平根据不同的电流信号来进行区分不同的肽序列；但由于这些方法中使用的蛋白去折叠酶以一种不规则的形式来介导蛋白的穿孔，离子电流和序列的对应关系有时难以解析。本文作者则使用了一个基于DNA纳米孔的单蛋白分子测序装置，它具有单个氨基酸分辨率，并能够通过多次重读来提高精度。

      在设计上，他们利用DBCO Click反应构建了DNA-肽偶联物，能够通过DNA互补片段（经典的纳米孔接头）进入杯状的突变纳米孔M2 MspA中，互补片段脱落后DNA解旋酶Hel30会将复合物逐步拉过纳米孔并产生电流，依次产生DNA信号、Linker信号和肽信号。其中DNA部分产生的信号和预测信号比较一致。

      接下来，他们收集了三种在D/E混合肽中带有W或G单碱基突变的偶联物的信号进行了对比。肽本身有带负电荷的D、E氨基酸组成，在C末端具有W或G的突变。单点突变明显影响了离子电流，而电流变化的差值和突变后碱基大小相关。后续作者使用MD模拟对这种变化模式进行分析，发现电流的变化和纳米孔收缩体积相关，而不同的突变会导致不同的纳米孔收缩情况。

       作者对上述单次读取序列结果的精确度进行了量化，发现有87%的较高正确率。而进一步，他们还通过增加解旋酶的浓度来对单一分子进行多次独立的重读。高解旋酶浓度下，控制孔内DNA运动的解旋酶后还会结合有额外解旋酶，当控制运动的酶到达DNA末端时它会自动脱落，导致DNA-肽缀合物回到纳米孔内，仍与DNA结合的额外解旋酶会重新开始控制DNA运动，导致一次重读；最终通过反转电压可以终止重读过程。作者检测到了多达117次的G单突变肽的重读事件；并发现随着重读次数的增加，精度也显著提升了。

      总之，作者使用了DNA-肽复合物以及纳米孔实现了对肽上单碱基突变的识别，并通过对单个肽分子的多次重读来获得了更高精度。

本文作者：MYZ

责任编辑：Guo ZH

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl4381

文章引用：DOI：10.1126/science.abl4381