二维(2D)黑磷纳米片(BPNSS)由于其独特的物理化学性质和优异的生物相容性而在纳米医学领域得到了广泛的研究。其可以有效地清除过量的ROS，以改善急性肾损伤。本文开发了一种创新的“纳米芯片输送药物”方法来治疗动脉粥样硬化。利用BPNSS的载药能力来装载分解蛋白D1(RvD1)，这是一种在脆弱的动脉粥样硬化斑块中发现缺乏的炎症分解脂质介质。虽然加载RvD1BPNSS清除周围的ROS，但BPNSs的降解选择性地在皮损巨噬细胞中释放RvD1，从而增强在载脂蛋白E缺陷(APOE−/−)小鼠动脉粥样硬化模型中的抗动脉粥样硬化效果(图1)。有效地向APOE−/−小鼠的皮损巨噬细胞传递促进分解的药物，突显了其在治疗动脉粥样硬化和其他炎症性疾病方面的前景。用超声将块状黑色磷粉在水溶液中进行液相剥离，制备了BPNSs。通过静电相互作用将合成的S2P-PEG-NH2包覆在BPNSs的表面；得到的材料被表示为BPNSs@PEGS2P。S2P多肽可靶向稳定蛋白-2，促进BPNSS在动脉粥样硬化中的摄取。为了进行比较，合成了BPNSs@PEG(不含S2P)，以评估BPNSs@PEGS2P的促进积累。

透射电子显微镜图像(图a)及原子力显微镜图像显示(图b)。聚乙二醇NH_2或S_2P-PEG-NH_2成功地对BPNSS进行了表面修饰。此外，FITC标记的S2P-PEGNH_2在BPNSs表面的包覆量约为35.5%(wt/wt%)，表明在BPNSs表面有效地包覆了聚乙二醇和S2P-靶向多肽。鉴于ROS在动脉粥样硬化进展中的关键作用，研究了BPNSS@PEGS2P对过氧化氢(H2 O2)、羟基自由基(·OH)和超氧阴离子(O2·−)等ROS的清除作用。发现共同表明，BPNSs@PEG-S2P可以作为一种有效的抗氧化剂来清除广泛的ROS(图c-e)，突出了其治疗动脉粥样硬化的潜力。BPNSs@PEG-S2P对RvD1具有很高的负载量和胶体稳定性(图f)，进一步表明BPNSs@PEG-S2P/R有望输送抗炎和抗氧化药物治疗动脉粥样硬化。在含有胎牛血清(FBS)的PBS溶液中，模拟动脉粥样硬化斑块的微环境，以弱酸性pH和高氧化应激为特征，研究了RvD1从BPNSS@PEG-S2P/R中的释放效率。结果表明，BPNSs@PEG-S2P/R能够以一种对pH和氧化应激反应的方式传递RvD1(图g)。RvD1的响应释放机制主要是由于在与RvD1释放研究相同的条件下选择性降解BPNSs@PEG-S2P(图2h)。

之后研究了BPNSs@PEG-S2P/R的生物相容性和细胞摄取，激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)和流式细胞仪分析表明，S2P多肽表面修饰可以提高巨噬细胞对BPNSs的摄取效率(图a，b)。为了评估BPNSs@PEG-S2P/R清除ROS和抗炎的能力，我们使用脂多糖(LPS)处理的RAW264.7细胞作为体外模型。CLSM图像(图c)和流式细胞仪分析(图d)表明，BPNSs@PEG-S2P/R显著减弱了脂多糖处理的RAW264.7细胞中过量产生的ROS(绿色荧光)。随后，抗炎分析显示，BPNSS@PEG-S2P/R有效地抑制了由脂多糖激活的RAW264.7和骨髓源巨噬细胞 (图e)分泌的各种促炎细胞因子的产生，为了研究BPNSS@PEG-S2P/R处理是否可以减少氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)的摄取和随后泡沫细胞的形成，预先处理RAW264.7和Movas细胞，然后与DiI标记的OX-LDL(DiI-OX-LDL)孵育。荧光显微镜和流式细胞仪分析表明，BPNSs@PEG-S2P/R显著抑制RAW264.7和Movas细胞对DII-OX-LDL的摄取(图f-I)，从而有效减少巨噬细胞和VSMC泡沫细胞的形成(图j，k)。这综上所述，我们的研究结果表明，BPNSS@PEG-S2P/R递送纳米平台既具有优异的ROS清除能力，又具有优异的抗炎效果。且认为有助于胆固醇外流并减少这些细胞类型中泡沫细胞的形成。

接下来，我们结合放射化学、流式细胞术和组织学方法，系统地研究了BPNSs@PEG-S2P/R在体内的药代动力学和生物分布，特别是在动脉粥样硬化斑块和血管细胞中的分布。首先采用了一种无螯合剂的方法用铜放射性核素标记BPNSS@PEGS2P/R(BPNSS@铜@PEGS2P/R)，并研究了它们在高脂饲料喂养12-13周的APOE−/−小鼠中的命运(图a)。在巨噬细胞丰富的清除器官，如脾和肝脏，BPNSS@铜@聚乙二醇-S2P/R和BPNSS@铜@聚乙二醇-S-R具有较高的初始摄取。肾脏、膀胱、胃和肠道等代谢器官的放射性显著增加，表明纳米制剂的肾脏、膀胱和胃肠道可能存在清除途径(图b)。此外，体外生物分布数据表明，在研究的所有时间点，经BPNSS@铜@聚乙二醇S2P/R处理的动脉粥样硬化性APOE−/−小鼠的64Cu信号始终高于BPNSS@64Cu@PEGS/R组或野生型BPNSS@铜@PEGS2P/R组(图c)。这些发现为使用S2P多肽靶向稳定蛋白-2并增强纳米疗法在动脉粥样硬化斑块中积累的合理性和可行性提供了令人信服的证据。体外全主动脉放射自显影显示 (图d，e)进一步证明S2P修饰显著增加了他们的主动脉蓄积。体内联合配准正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像用于评估铜标记纳米制剂的生物分布，并通过体外放射性正电子发射断层扫描定量(图f，g)进行验证。表明BPNSs@PEG-S2P/R治疗可促进主动脉聚集。体外近红外荧光成像显示，经Cy7标记的BPNSS@PEGS2P(BPNSS@PEGS2P/Cy7)治疗的APOE−/−小鼠显示主动脉内聚集增强(图h，i)，这与体外放射化学生物分布、ARG和正电子发射计算机断层扫描结果一致。主动脉根部切片的共聚焦显微镜显示，BPNSs@PEG-S2P/Cy7的Cy7荧光信号大约是BPNSs@PEG/Cy7处理的1.3倍(图l)。值得一提的是，流式细胞仪分析显示，与脾相比，动脉粥样硬化的动脉中Ly6chi单核细胞摄取BPNSs@PEG-S2P/R/Cy5的比例更高(图m)。

之后评估了BPNSs@PEGS2P/R在治疗的载脂蛋白斑块−/−小鼠中的抗动脉粥样硬化效果(图a)。油红O(ORO)染色结果提供证据表明，BPNSs@PEG-S2P/R显著减少了动脉壁9，48(图b，c)的动脉粥样硬化斑块面积，包括整个主动脉(图d)、主动脉根部(图e)和头臂动脉(图f)的病变区域。主动脉根部苏木精伊红(H&E)染色分析显示，BPNSs@PEG-S2P/R处理有效地减少了斑块中的坏死核心面积(图g，红色五角星)(图g，k，用黑虚线标记的面积)。此外，我们使用Masson的三色染色分析斑块中的胶原帽面积(图h，蓝色)(图h，用黑虚线标记的区域)。在BPNSS@PEGS2P/R处理的小鼠中，观察到最大的胶原面积为23.4×104微米2(图h,l)。这些发现表明，这种治疗增强了斑块的稳定性，潜在地降低了斑块破裂和血栓形成的风险。此外，我们使用免疫组织化学方法研究了巨噬细胞负荷(CD68；图5I)和基质金属蛋白-9(MMP9)的表达(图j)，它们与斑块的发展和动脉粥样硬化的严重程度相关。染色结果显示，BPNSs@PEG-S2P/R可显著降低CD68和MMP-9在病变中的表达(图m，n)，进一步表明BPNSs可有效减少巨噬细胞负荷和促进破裂的基质金属蛋白酶的表达。补充结果提供了BPNSs@PEG-S2P/R抗动脉粥样硬化功效的其他细节。

这项研究展示了一种结合治疗剂的纳米平台的开发，提供了一种治疗动脉粥样硬化的新方法，并强调了基于BPNS的药物输送系统在治疗其他炎症性疾病方面的前景。

本文作者：ZYL

责任编辑：FC

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41565-024-01687-1