细菌感染时宿主体内微环境对病原菌活动有显著影响，这也导致体外研究的结论与体内实际感染中的情况时有不同。因此开发直观高效、可实时分析活体内细菌感染动态的新的研究方法仍非常必要。

目前，细菌活体成像主要依靠基因工程改造菌株，但部分细菌的改造难度大，且低氧环境下荧光强度往往不足。近年来研究者也开发了多种靶向细菌的体内标记成像的化学方法，但限于标记特异性或医学影像学成像方法的分辨率，大部分无法通用于野生型细菌的活体显微成像。作为一种靶向代谢标记细菌肽聚糖的分子工具，荧光D型氨基酸（FDAA）探针在细菌标记的特异性、覆盖率和效率等方面展现出了独特优势。然而，目前已报道的大多数FDAA探针其发射波长不超过700纳米，组织穿透能力有限。而且FDAA探针通过灌胃进行活体细菌标记后易被宿主吸收，导致组织荧光背景高而无法进行活体成像。

针对以上问题，近期复旦大学王炜团队与上海交通大学医学院附属仁济医院麻醉科杨立群、高坡团队合作开发了一种基于近红外FDAA探针的野生型病原菌在体原位标记和活体成像新策略。作者首先设计并合成了带有Cy7修饰的FDAA近红外荧光探针Cy7ADA，并发现其对多种常见的病原菌具有高效的标记能力。其后，研究者进一步研究了其在体内进行细菌标记的效果。他们利用携带绿色荧光蛋白（GFP）的金黄色葡萄球菌进行小鼠肝脓肿造模，发现在腹腔注射Cy7ADA后，可在肝脏组织的冰冻切片上观察到Cy7信号，并且与GFP重合，表明Cy7ADA能够高效、特异地标记体内的病原菌。

在腹腔注射探针后4h，作者发现感染小鼠体内的游离探针基本已排泄完毕。在此时间点将小鼠麻醉后，暴露其肝叶利用共聚焦显微镜下进行活体成像。与对照组相比，感染小鼠肝脏中观察到大量细菌信号，并且许多细菌聚集在细胞核周围，提示其位于细胞内。同时进行库普弗细胞免疫荧光染色（KCs）后，显示 KCs 中也有细菌信号，表明这些巨噬细胞在清除病原体中发挥了作用，但是 FDAA 的标记提示这些细菌在 KCs 内仍存活。利用Cy7探针的深层组织穿透能力，作者也进行了z轴层扫，成功重建了～45 μm 厚的三维组织，清晰显示 KCs 吞噬细菌后的形态。作者后续又研究了这一方法在监测抗生素疗效评估中的潜力，发现 Cy7ADA 标记信号的强弱能够准确反映肝脏病原菌负荷的动态变化。进一步对Cy7ADA探针标记后的感染肝脏进行CUBIC透明化处理，借助光片荧光显微镜可精细观察到单个细胞的肝细胞核和Cy7ADA标记后的细菌。

这一研究表明，FDAA探针的灵活使用有助于在病原菌活体感染中的定性定量研究。另外，配合更多的探针设计、优化的样品处理以及各类先进的成像仪器，有望将这一策略应用于更多更深入的病原菌和感染研究之中。