分享一篇发表在JACS上的文章，文章的题目是“A Bioorthogonal Precision Tool for Human N-Acetylglucosaminyltransferase V”，通讯作者为伦敦帝国理工学院的Benjamin Schumann教授，主要研究方向是糖化学生物学，致力于糖相关的化学生物学工具的开发。
聚糖是人体健康的重要调节剂，深度参与了信号传导，物质运输以及免疫等多种生物过程。在先前的研究中，N-糖生物合成的失调被发现与多种疾病密切相关，例如在肿瘤组织中，N-乙酰葡糖胺基转移酶Ⅴ（MGAT5）的高表达通常会导致N-糖侧链增多从而削弱肿瘤细胞的黏附能力，促进癌症的转移。因此，针对MGAT5的研究也在癌症治疗中受到了大量关注。目前，MGAT5的分子结构和催化机理虽然已经得到了一定的研究，但是生物层面上，考虑到N-糖基化过程的复杂性，人们对于究竟哪些N-糖基化位点会受到MGAT5的特异性修饰并导致侧链增多，而哪些位点的结构特征又会阻碍MGAT5参与反应这一问题仍缺乏足够的认识。因此开发新的化学生物学工具，探究MGAT5特异性修饰蛋白和参与反应的N-糖基化位点变得至关重要。在本文中，针对上述问题，作者基于Bump and Hole策略对MGAT5进行突变改造，开发了一种新的用于研究MGAT5修饰特点的化学生物学工具。这里作者首先选择了9种MGAT5天然底物UDP-GlcNAc的生物正交官能团化衍生物作为候选底物并进行了化学酶法合成，这些官能团化的UDP-GlcNAc较天然底物突出的部分作为该策略中的“Bump”，而为了在MGAT5上进行打孔以容纳外源的Bump，作者对MGAT5及其底物复合物进行了分子动力学模拟。经模拟发现，V455，F458以及F517是造成位阻的关键残基，因此作者选择了这三个位点对MGAT5进行了突变改造来提供更多的额外空间来容纳外源底物。随后，为了寻找具有最佳反应选择性的MGAT5突变体，作者采用了NGA2 N-糖中间体进行了体外活性检测。结果表明，所有的突变体对天然底物的反应选择性都发生了显著降低，且多数突变体对UDP-GlcNButAz都表现出了一定的选择性提升。综合考虑选择性和转化率，作者最终选定了F458V/F517L这一对UDP-GlcNButAz具有52%转化率，且对天然底物UDP-GlcNAc仅有4%转化率的高选择性突变体作为优势突变，并命名为BH-MGAT5。同时，作者此处也得到一个有意思的发现，即野生型MGAT5对9种非天然糖均存在一定的转化率，表明了其底物混杂性。得到高选择性的突变体BH-MGAT5后，作者将其应用于MGAT5特异性修饰糖蛋白的生物正交标记中。这里作者选择了牛胎球蛋白和缺乏内源MGAT5活性的中国仓鼠卵巢细胞膜蛋白组分作为模型蛋白，通过β-半乳糖苷酶对其上的N-糖进行切割，使其重塑为可被MGAT5识别的NGA2结构。随后作者将蛋白底物与BH-MGAT5以及UDP-GlcNButAz共孵育，并通过CuAAC连上biotin，再进行streptavidin blot来检测BH-MGAT5是否能将GlcNButAz引入N-糖中。结果表明BH-MGAT5能够高效地掺入非天然糖，且反应活性几乎不受UDP-GlcNAc浓度影响。相比之下野生型MGAT5则表现出了微弱的掺入能力。后续作者进一步通过质谱检测，鉴定了经BH-MGAT5孵育前后的糖型，进一步证明了该策略的可行性和高选择性。总而言之，本文基于Bump and Hole策略，对N-乙酰葡糖胺基转移酶MGAT5进行高选择性改造，开发出了一个可用于研究MGAT5特异性修饰糖蛋白的化学生物学工具。为研究MGAT5在N-糖基化过程中所扮演的角色提供了一个新的视角和方法，也为后续糖相关疾病的研究和治疗提供了潜在的化学生物学工具。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c05955文章引用：DOI：10.1021/jacs.4c05955
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