膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge. 是常用中药，具有补气固表、利水消肿、生津养血、脱毒排脓的功效^[1]。膜荚黄芪的活性成分主要包括皂苷类、多糖类和异黄酮类^[2]。其中异黄酮类化合物毛蕊异黄酮葡萄糖苷（calycosin-7-O-β-D-glucoside）是评价黄芪药材质量的“标记化合物”之一^[1]，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、保肝和增强骨质再生等多种药理作用^[3-4]。随着黄芪野生资源的减少，现主要依赖于人工栽培，但由于人们不了解毛蕊异黄酮葡萄糖苷生物合成机制，盲目生产，导致在栽培过程中植株内毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量不稳定。目前，黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定主要采用高效液相色谱法（HPLC），此法具有操作简便、准确可靠和重复性好的优点^[1,5]。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia- lyase，PAL）催化L-苯丙氨酸形成肉桂酸，是生物合成苯丙烷类化合物的第一步，也是苯丙烷途径的关键酶和限速酶^[6]。而苯丙烷类化合物是植物中生物合成黄酮、异黄酮、花青素、香豆素、茋类和水杨酸等酚类产物的前体物质^[7]。PAL基因在植物中通常以小的基因家族形式存在，如拟南芥中存在4个PAL基因（AtPAL1、AtPAL2、AtPAL3、AtPAL4），其中AtPAL1和AtPAL2聚为一类，而AtPAL3和AtPAL4聚为另一大类^[8-10]。吴松权等^[11]首次从膜荚黄芪中克隆一个PAL基因（AmPAL），Genbank登陆号为EF567076，但并没有进行基因表达分析，也没有分析AmPAL基因的表达与其下游次生代谢产物积累之间的关系。本研究利用同源克隆和RACE技术从膜荚黄芪中克隆PAL基因家族成员，并用生物信息学分析这些PAL基因的序列特征；利用实时荧光定量PCR技术测定PAL基因家族成员在不同组织中的表达特性，分析每个PAL基因表达与下游产物毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量变化的关系，为揭示膜荚黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷积累的分子机制奠定理论依据。

1  材料、试剂和仪器

1.1  材料

膜荚黄芪种植于延边大学农学院中草药圃地，由延边大学全雪丽教授鉴定为黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.。取一部分新鲜的根、茎、叶，用液氮冷冻后保存于−80 ℃超低温冰箱中，用于总RNA提取；另一部分样品于50 ℃的烘干箱中烘干至恒定质量，用于毛蕊异黄酮葡萄糖苷的提取。

1.2  试剂和仪器

TRIzoL试剂购自Invitrogen 公司；合成cDNA第一条链的试剂盒购自Toyobo公司；5’和3’ RACE 试剂盒购自Clontech公司；DNA凝胶回收试剂盒和PMD-19T载体试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司；对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号110907）购自上海融禾医药科技有限公司，质量分数大于98%；乙腈和甲醇为色谱级，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

T100^TM型PCR仪（Bio-Rad公司）；Mx3005P型荧光定量PCR仪（安捷伦公司）；−80 ℃超低温冰箱（海尔集团有限公司）；CR22G型高速冷冻离心机（Hitachi公司）；MI-78A型高压蒸汽灭菌锅（施都凯仪器公司）；岛津高效液相色谱仪（LC-10ATVPPlus）；Unitary C₁₈反相色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），华谱科仪科技有限公司；RE-2000B型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DLSB-5/20型低温冷却液循环泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；KQ-500D型数控超声波清洗器（昆山市超速仪器有限公司）；BAO-250A型精密鼓风干燥箱（上海施都凯仪器设备有限公司）；RHP-600型高速多功能粉碎机（浙江荣浩工贸有限公司）。

2  方法

2.1  总RNA提取与cDNA合成

参照Invitrogen公司的TRIzol一步法提取总RNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000 C超微量分光光度计检测其质量和浓度；按照Toyobo公司反转录试剂盒的步骤合成cDNA第1条链。

2.2  PAL基因保守区克隆

从NCBI的Genbank中下载已登陆的豆科植物及拟南芥等模式植物的PAL基因同源序列，利用Primer Premier 5.0软件设计了1对AmPAL基因的兼并引物AmPAL-DF和AmPAL-DR（表1）。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。以合成的cDNA第1条链为模板，进行PCR扩增，反应体系为20 μL：10×PCR Buffer 2.0 μL，25 mmol/L MgCl₂ 2.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，cDNA模板1 μmol/L，2.0μL，上游引物AmPAL-DF 2.0 μL，2 μmol/L下游引物AmPAL-DR2.0 μL，5 U ExTaq酶0.2μL，剩余用超纯水补足。反应条件：94 ℃预变性2min，94 ℃变性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸45s，32个循环；72℃延伸5 min。取PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，DNA凝胶回收试剂盒回收后，连入PMD-19T载体。将重组质粒转化至大肠杆菌感受态JM109，通过蓝白斑筛选，挑取白斑，将提取的重组质粒DNA原液稀释50倍后，使用M13引物（表1）进行PCR检测。PCR检测的反应体系和条件同上述克隆PCR，检测为阳性的克隆菌株进行测序，测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

2.3  5’RACE和3’RACE扩增

根据3个PAL基因家族的保守序列分别设计3对5’RACE和3’RACE的特异引物AmPALsGSP1和AmPALsGSP2（表1），引物由上海英骏生物技术有限公司合成。5’RACE和3’RACE扩增的具体反应体系和条件参照Clontech公司的SMARTer^TM RACE cDNA扩增试剂盒说明书进行。PCR产物克隆与测序同上述“2.2”项。

2.4  PAL基因编码区克隆

用Lasergene软件包中SeqMan分别对3个AmPAL家族的保守区、5’RACE和3’RACE的序列进行拼接获得了3个AmPAL家族的全长cDNA，并分别设计了3对包括完整开放阅读框（编码区）的引物（表1）。反应体系与保守区克隆一致，反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物克隆与测序同“2.2”项。

2.5  生物信息学分析

用Lasergene软件预测编码区、蛋白相对分子质量和等电点；通过NCBI-blast进行同源性分析并下载其他植物PAL氨基酸序列；利用ExPASy ProtScale服务器分析蛋白疏水性；利用PSIPRED服务器对蛋白质二级结构进行预测，用TargetP 1.1服务器预测亚细胞定位情况；用SignalP 4.1服务器预测信号肽；通过Lasergene软件比对PAL蛋白家族，分析其保守域和结构域，构建PAL氨基酸序列系统发育进化树。

2.6  实时荧光定量PCR

针对获得的3个AmPAL家族的特异序列分别设计了3对荧光定量PCR引物（表1），所用内参基因为黄芪18 S基因（Genbank登陆号为AF359594，表1）。反应体系为20 μL，除了SYBR 10 μL和ROX 2 μL外，其他同“2.2”项。反应程序：95 ℃ 预变性10 min，95 ℃ 变性10 s，60 ℃ 退火10 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。以标准的AmPAL和18 S基因拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制各自的标准曲线。之后，根据未知样品的CT值，即可在各自标准曲线中得到样品的拷贝数，再求出相对于内参基因18 S的相对表达量。每组样品进行3次重复检测。

2.7  毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定

毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定，采用李子羊等^[12]的HPLC方法进行，每组样品3次重复。

2.8  统计分析

数据分析采用SPSS 19.0软件的ANOVA分析，多重比较采用Duncan新复极差法（P＜0.05），相关性分析采用Pearson相关系数。

3  结果与分析

3.1  AmPAL基因全长cDNA克隆与序列分析

以膜荚黄芪根总RNA反转录的cDNA为模板，用兼并引物扩增得到了1条大约750 bp的片断（图1泳道1），测序结果显示AmPAL基因由长度均为752 bp的3个基因构成。

根据保守区测序结果设计了3对5’RACE和3’RACE的特异引物（表1），PCR扩增结果分别获得AmPAL1的5’端序列938bp（图1泳道2）和AmPAL1的3’端序列1 989 bp（图1泳道3）、AmPAL2的5’端序列1 739 bp（图1泳道4）和AmPAL2的3’端序列1 270 bp（图1泳道5）、AmPAL3的5’端序列601 bp（图1泳道6）和AmPAL3’端序列1 939 bp（图1泳道7）。

使用Lasergene软件包中SeqMan分别对3个AmPAL家族的序列拼接获得了3个AmPAL家族的全长cDNA序列，利用设计的3对包括编码区在内的引物（表1），PCR结果分别获得了AmPAL1的2 157 bp序列（图1泳道8）、AmPAL2的2 210 bp序列（图1泳道9）和AmPAL3的2 215bp序列（图1泳道10），测序结果与拼接结果完全一致，Genbank登陆号分别为KY086279（AmPAL1）、KY086280（AmPAL2）和KY086281（AmPAL3）。

核苷酸序列和氨基酸序列分析结果表明AmPAL1的cDNA全长为2 508 bp，其中编码区为2 157 bp，5’非翻译区（5’-UTR）为81 bp，3’非翻译区（3’-UTR）为242 bp，以及28 bp的polyA尾，推测其编码718个氨基酸；AmPAL2的cDNA全长为2 401 bp，其中编码区为2 157 bp，5’非翻译区（5’-UTR）为105 bp，3’非翻译区（3’-UTR）为110 bp，以及29 bp的polyA尾，推测其编码718个氨基酸；AmPAL3的cDNA全长为2 498 bp，其中编码区为2 157 bp，5’非翻译区（5’-UTR）为111 bp，3’非翻译区（3’-UTR）为205 bp，以及25 bp的polyA尾，推测其编码718个氨基酸。核苷酸序列相似性分析表明，AmPAL1与AmPAL2和AmPAL3的一致性分别为79.8%和78.3%，AmPAL2与AmPAL3的一致性为92.3%。

3.2  AmPAL生物信息学分析

用Lasergene软件包中Protean对预测的氨基酸序列分析表明，AmPAL1蛋白相对分子质量77 920，等电点为5.86，酸性氨基酸82个，碱性氨基酸66个，极性氨基酸188个，疏水性氨基酸259个；AmPAL2蛋白相对分子质量78 260，等电点为5.92，酸性氨基酸80个，碱性氨基酸67个，极性氨基酸197个，疏水性氨基酸257个；AmPAL3蛋白相对分子质量78 430，等电点为5.98，酸性氨基酸81个，碱性氨基酸68个，极性氨基酸197个，疏水性氨基酸255个。

氨基酸序列相似性分析表明，AmPAL1与AmPAL2和AmPAL3的一致性分别为88.1%和88.5%，AmPAL2与AmPAL3的一致性为96.4%。在NCBI网站上进行保守结构预测分析，3个AmPAL蛋白均含有phe_am_lyase、Lyase_aromatic、PAL-HAL、HutH 4个结构域，属于Lyase_I_like和PLN02457超家族，均含有苯丙氨酸解氨酶的特征序列GTITASGDLVPLSYIA（200-216）^[13]。氨基酸序列比对结果如图2所示，AmPAL1与AmPAL2和AmPAL3之间的差异在N端较大，不过3个AmPAL蛋白均含有PAL保守的脱氨基位点（L-208、V-209、L-258、A-259）和催化活性位点（N-262、G-263、NDN-[384-386]、HNQDV-[488-492]）^[14]。而且，其特征序列中均包含1个丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸三联体的保守区域，它可以自催化转换，通过内部环化脱水，形成MIO电辅基，而丝氨酸残基则被认为是各个物种中PAL蛋白中高度保守的活性位点^[15]。

疏水性分析显示，3个AmPAL蛋白均为亲水性蛋白；二级结构预测结果，3个AmPAL蛋白均以α-螺旋（54.1%～55.1%）和无规卷曲（41.6%～42.1%）为主，β-折叠（3.9%～4.2%）含量则较少；不存在信号肽序列；定位在细胞质。

为了研究3个AmPAL与其他植物PAL的进化关系，利用Clustal W方法对氨基酸序列比对后，构建了系统进化树，结果如图3所示，基本按照不同科聚类，3个AmPAL与同属于豆科的蒺藜苜蓿和大豆聚为一类，但不同科之间PAL有很高的相似性。与拟南芥PAL家族比较，3个AmPAL均与AtPAL1和AtPAL2亲缘关系较近，同时AmPAL1和已报道的AmPAL^[11]聚为亚类，明显区别于AmPAL2和AmPAL3构成的亚类。

3.3  AmPAL组织特异性表达与毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的变化

利用3对AmPAL的荧光定量PCR引物（表1）进行特异PCR，分别获得了长度为183、241和125 bp的特异序列，测序结果与AmPAL1、AmPAL2和AmPAL3的cDNA序列完全一致。之后，运用实时荧光定量PCR技术，分析了膜荚黄芪植株根、茎、叶3个不同组织中3个AmPAL的表达特性。结果如图4所示，3个AmPAL在根、茎、叶中均表达，但是表达量明显存在差异，在检测的所有组织中3个AmPAL表达量大小顺序为AmPAL1＞AmPAL2＞AmPAL3；但只有AmPAL2在不同组织中的表达量与毛蕊异黄酮葡萄苷含量变化一致（即根＞茎＞叶）（图5）且Pearson相关系数为0.949，AmPAL1在不同组织中的表达量大小为茎＞根＞叶，而AmPAL3在根和茎中表达量一致，在叶中表达量最小。

4  讨论

黄芪黄酮类化合物主要包括黄酮、黄酮醇类、异黄酮类和花青素等，其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷是含量最高的异黄酮类化合物，它具有多种药理作用，是评价黄芪药材质量的标记化合物之一^[1-2]。PAL是生物合成苯丙烷类化合物的第一个酶，也是生物合成异黄酮的关键酶之一^[16]。植物PAL通常由多个基因编码，它们的不同成员在不同组织中的表达特性不同，参与的代谢途径也不同^[8-9]。但是，还不清楚哪个或哪些PAL基因参与了膜荚黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的生物合成。

本研究利用同源克隆和RACE技术，从膜荚黄芪中克隆了3个AmPAL，生物信息学分析结果表明这3个AmPAL是典型的PAL基因家族成员。由进化树分析结果可知，相对于拟南芥PAL3和拟南芥PAL4，所克隆的3个AmPAL与拟南芥PAL1、PAL2亲缘关系更近（图3）。有研究表明在拟南芥4个PAL基因中，只有拟南芥PAL1和PAL2参与了黄酮类的生物合成^[10]，暗示所克隆的3个AmPAL均与黄酮类生物合成密切相关^[10]。不过，这3个AmPAL在不同组织中的表达特性明显不同（图4），AmPAL2在根、茎、叶中的表达量均介于拟南芥PAL1和PAL3之间，并且只有AmPAL2在不同组织中的表达方式与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累相关（图5），而且二者之间还存在较高的相关性（0.949），推测AmPAL2与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的生物合成密切相关。不过，这还需要进一步的实验来验证。

总之，本研究成功地从膜荚黄芪中克隆了3个AmPAL，推测这些基因可能与黄酮类生物合成相关，其中AmPAL2的表达与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累密切相关。

参考文献（略） 

来  源：刘俊频，李胜立，袁  元，郑玲辉，全雪丽，吴松权. 膜荚黄芪3个苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析 [J]. 中草药, 2019, 50(7):1669-1675.