银杏内酯B（ginkgolide B，GB）是银杏内酯中生理活性最强、迄今发现的最有效的血小板活化因子受体拮抗剂^[1-2]，具有抗休克、抗过敏、抗菌、抗炎、保护中枢神经系统和减少缺血性损伤等功 效^[3-12]。常用的含GB或以GB为主要药效成分的银杏类注射剂包括舒血宁注射剂（SXN）^[13]、银杏叶提取物注射剂（GEB）^[14-15]、银杏内酯注射剂   （GK）^[16]、注射用银杏二萜内酯等^[17]，但是GB几乎不溶于水的理化性质限制了其注射剂的开发和应用^[18]。目前含GB的注射剂均含有较多的表面活性剂^[19]，使用前需要先加入到大量的氯化钠输液中，缓慢静脉滴注，并需要严格控制滴速^[20]；如果注射速度过快便会导致病人死亡^[21]。

纳米传递系统可以将难溶药物溶解、吸附、包埋、包封或共价结合在纳米载体的表面或内部^[22-25]，达到增加药物的溶解性能或达到一定的缓释效果。目前已有不少报道将银杏内酯制备成聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒（PBCA-NP）和聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯纳米粒（PCL-PEG-PCL NPs）等，旨在提高药物的生物利用度，或使其适合应用于静脉注射，但由于所制备的纳米制剂的不稳定性，往往需要加入大量稳定剂^[26-27]。

本实验针对GB溶解度小，体内消除快以及目前已有注射剂的缺陷等，拟采用一种以葡聚糖为基底并对其进行修饰的多糖聚合物（ZY-010）作为载体制备GB纳米粒（GB-NP）。ZY-010是一种可生物降解的新型高分子材料，可以批量生产并达到无菌和无热原的要求，符合注射剂原辅料的标准；并且在不添加任何稳定剂和表面活性剂的情况下，可增加难溶性物质的溶解度和延缓药物释放速度，目前ZY-010已经在美国用于紫杉醇注射剂的生产并申报临床试验。本实验首次以ZY-010为载体对GB进行静脉注射制剂的研究。利用星点设计（central compositedesign，CCD）和效应面优化法（response surface method，RSM）实验次数相对较少、精密度高、优选条件预测性好的特点^[28]，本研究首先拟采用CCD-RSM优化GB-NP的制备工艺，随后为了避免液体纳米制剂贮存过程中不稳定的缺陷，拟进一步将GB-NP制备成纳米冻干制剂，并考察其冻干前后平均粒径、多分散系数（polydispersity index，PDI）、稳定性及体外释放特征等，为GB静脉注射剂的产品开发奠定基础。

1  仪器与材料

Waters高效液相色谱仪（PDA），Waters公司；XS105十万分一电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州科创仪器有限公司；SHZ-D（III）循环水式多用真空泵，河南省予华仪器有限公司；KH-250E超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；380ZLS激光粒度测定仪，美国Nicomp公司；pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；5810REppendorf台式高速大容量离心机，德国Eppendorf公司；MC-100B恒温摇床，牟测科技；Mill-Q超纯水器，Millipore公司。

GB对照品，中国食品药品检定研究院，质量分数以95.60%计，批号110863-201611；GB原料药，成都德思特生物技术有限公司，质量分数≥95.00%，批号DST190318-096；ZY-010，批号ZYT- HZ0251，由美国ZY Therapeutics Inc. 提供，具体的合成细节参见美国专利PCT/US18/28900；胎牛血清，Gibico公司；无水乙醇为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯；去离子水为超纯水；超滤离心管，截留相对分子质量3 500，Millipore公司；透析袋，截留相对分子质量3 500，Solarbio公司。

2  方法与结果

2.1  GB-NP的制备方法

采用亲水性聚合物凝聚法制备GB-NP。按处方精密称取适量聚合物和GB粉末，分别溶于去离子水和无水乙醇。聚合物溶液加一定量的乙酸调节溶液pH值作为水相，过0.22 μm的微孔滤膜，并将聚合物溶液保持在60 ℃下10 min；以一定质量浓度的GB乙醇溶液作为有机相，过0.22 μm的微孔滤膜；在60 ℃恒温条件下，将有机相缓慢注入到水相后，超声（频率40 kHz，功率250 W）10 min，即得GB-NP溶液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

2.2  GB体外HPLC含量测定方法的建立

2.2.1  检测波长的选择  取适量GB对照品用甲醇溶解，在波长210～400 nm内进行光谱扫描，结果显示，GB在225 nm处有最大吸收，因此选择225 nm作为检测波长。

2.2.2  色谱条件 色谱柱为Ultimate^®XB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（30∶70）；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；目标波长225 nm；进样量20 μL。理论塔板数以GB峰计算不低于2 500。

2.2.3  阴性对照溶液的制备  精密称取ZY-010聚合物4.93 mg置于5 mL量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，作为阴性对照溶液。

2.2.4  对照品溶液的制备 精密称取GB对照品10.02 mg置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液，质量浓度为1.002mg/mL。

2.2.5  供试品溶液的制备 精密移取按“2.1”项方法制备的GB-NP溶液，超速离心后，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.6  色谱专属性考察  分别取阴性对照溶液、GB对照品溶液和供试品溶液各20μL进样。色谱图见图1，可见阴性对照在GB出峰处（约12 min）无干扰。

2.2.7  线性关系的考察  分别精密移取GB对照品储备液适量，配制成10、20、40、80、100、400、600、1 000 μg/mL的系列对照品溶液，过0.22 μm微孔滤膜，在“2.2.2”色谱条件下分别进行测定，记录峰面积，以质量浓度为横坐标（X），相应峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程Y＝507.89 X－3 406.3，r＝0.999 9，结果表明GB在10～1 000 μg/mL具有良好的线性关系。

2.2.8  精密度试验  取400 μg/mL的GB对照品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件分别于1 d内测定6次，连续测定6 d（每天1次），计算日内、日间精密度，记录峰面积，结果其日内精密度RSD为0.32%，日间精密RSD为0.55%。说明日内、日间精密度良好。

2.2.9  重复性试验  分别取同一批次的GB-NP供试品6份，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定峰面积，按照回归方程计算样品中GB的平均质量浓度为102.97 μg/mL，其RSD为1.34%，表明该方法重复性良好。

2.2.10  稳定性试验  精密吸取GB-NP供试品溶液1 mL，按“2.2.2”项下色谱条件，室温放置，于0、2、4、6、8、10、12 h分别进样测定，结果12 h内供试品溶液中GB峰面积的RSD为1.04%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.11  加样回收率试验  精密吸取9份阴性对照溶液0.3 mL，分成3组，各组分别加入110、140、170 μg/mL GB对照品储备液0.3 mL，各3份，混匀。12 000 r/min超速离心（4 ℃）10 min后，取上清液0.5 mL过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液按“2.2.2”项下色谱条件进样，测定续滤液中GB的含量，以测定值与实际值之间的比值为方法回收率。结果表明，低、中、高3个质量浓度的平均方法回收率分别为101.99%、96.68%、98.10%，RSD值分别为1.37%、1.33%、1.18%，说明建立GB的HPLC分析方法符合要求。

2.3  GB-NP处方优化的单因素考察

根据预试验结果，以纳米粒的平均粒径和PDI（具体测定方法同“2.6.2”项）为指标，对水相聚合物溶液pH值、GB与聚合物的质量比（W_GB/W_ZY-010）、GB质量浓度和超声时间作为单因素考察因素。

2.3.1  水相聚合物溶液pH值考察 固定处方中GB质量浓度为1.0 mg/mL、W_GB/W_ZY-010为0.1、超声时间为10 min，考察水相中聚合物溶液的pH值对GB-NP平均粒径和PDI的影响，结果见表1。结果表明，水相聚合物溶液pH值对GB-NP的平均粒径和PDI有较大影响。pH值在5.0时平均粒径和PDI均符合注射剂后续滤过除菌及进一步制备的要求。

2.3.2  W_GB/W_ZY-010考察 固定处方中GB质量浓度为1.0 mg/mL、水相聚合物溶液pH值为5.0、超声时间为10 min，考察W_GB/W_ZY-010对平均粒径和PDI的影响，结果见表2。W_GB/W_ZY-010对GB-NP的平均粒径和PDI有一定影响。随着W_GB/W_ZY-010减小，平均粒径呈明显上升趋势，PDI有所减低。考虑到载药量以及经济成本，特别是后续静脉注射剂滤过除菌的需要，本研究拟选择W_GB/W_ZY-010为0.1。

2.3.3  GB质量浓度对GB-NP平均粒径和PDI的影响 固定水相聚合物溶液pH值为5.0、W_GB/W_ZY-010为0.1、超声时间为10 min，对GB质量浓度进行考察，结果见表3。结果表明，GB质量浓度对GB-NP的平均粒径和PDI有一定影响。GB质量浓度增大，平均粒径减小，PDI逐渐增大。当GB质量浓度达到2 mg/mL时，PDI大于0.22，不利于后续的过膜除菌。故选择GB质量浓度为1.5 mg/mL。

2.3.4  超声时间对GB-NP平均粒径和PDI的影响 在GB-NP制备过程中需要用到超声，以阻止纳米粒聚合。固定处方中GB质量浓度为1.0 mg/mL、水相聚合物溶液pH为5.0、W_GB/W_ZY-010为0.1，对超声时间进行考察，结果表明，在此制备条件下，超声时间在5～20 min时对GB-NP平均粒径和PDI的改变无统计学意义（表4）。故结合实际情况，选择超声时间为10 min。

2.4  CCD-RSM优化GB-NP处方

2.4.1  因素水平的确定  在单因素实验筛选的基础上，以平均粒径和PDI作为评价指标，选取GB质量浓度（A）、W_GB/W_ZY-010（B）、溶液pH值（C）进行考察，设置其筛选范围分别为A 0.5～2.5 mg/mL，B 0.075～0.125，C 4.0～6.0。采用Design-Expert 8.0软件进行试验设计，试验设计及结果见表5。

2.4.2  数学模型拟合与分析  采用Design-Expert 8.0软件对数据进行处理及效应面处方优化，分别以平均粒径（Y₁）和PDI（Y₂）为因变量，以A、B、C为自变量进行模型拟合，结果表明各因变量与自变量以二项式方程拟合时相关系数（r²）最大，Y₁和Y₂二项式拟合方程分别为Y₁＝189.46－24.80 A－1.77 B－0.23 C＋4.76 AB＋9.49 AC－2.59 BC＋8.17 A²－3.37 B²－17.16 C²，r²＝0.881 7；Y₂＝   0.19＋0.014 A－0.051 B＋3.125×10^{−3 C}－0.016  AB＋0.010 AC＋0.032 BC＋0.011 A²＋0.083 C²，  r²＝0.701 4。

此模型的拟合度较高，能较好地反映3个考察因素与评价指标之间的关系。对各指标进行方差分析，结果表明Y₁和Y₂通过2项式拟合的模型均具有显著差异（粒径模型P值为0.001 4，PDI模型P值为0.037 7，P＜0.05），失拟项的显著性均不明显（粒径失拟项P值为0.069 6，PDI失拟项P值为 0.074 0，P＞0.05）；根据P值可知A和C对Y₁的影响尤为显著，而B和C对Y₂的影响更加显著，因此在响应面分析时，采用Design-Expert 8.0设计软件，依据所拟合的数学模型，分别绘制评价指标对2个考察因素的三维效应面图，另外1个因素置为中心值，结果见图2、3。

2.4.3  效应面分析预测与制备工艺优化  因为Y₁和Y₂是影响GB-NP质量的重要因素，故选用该模型并绘制相应的效应面图，在此基础上对GB-NP的制备工艺进行分析和预测。分析每一效应面图中的考察因素的交互作用，根据软件预测结果，并结合研究的实际情况（GB-NP平均粒径＜200 nm， PDI＜0.2），最终确定纳米粒的制备工艺条件为GB质量浓度为1.5 mg/mL，W_GB/W_ZY-010为0.1，溶液pH值为5.0。

2.5  优化工艺验证实验

为验证模型预测的准确性，按照上述所优化的制备工艺制备了3批GB-NP样品，并对其进行平均粒径和PDI分析，将2个评价指标的实验实际值与模型预测值进行相关性分析，计算两者间的偏差，偏差＝(模型预测值－实验实际值)/模型预测值。结果表明，实际值与模型预测值的偏差较小，工艺重复性好，因此本实验所拟合的多元二项式方程能够较好反映各因变量与自变量间的关系，能满足预测要求，见表6。

2.6  GB-NP理化性质考察

2.6.1  透射电镜法观察GB-NP形态 移取少量GB-NP溶液，用纯水稀释至适当浓度，滴至载玻片上，用2.0%磷钨酸负染后转移至专用铜网上，自然挥干，用透射电子显微镜观察粒径大小和形态并拍摄照片，结果见图4。由图4可见GB-NP呈圆球形，粒子大小均匀，未见粘连和聚集的现象。

2.6.2  GB-NP粒径及其分布、Zeta电位考察 取GB-NP溶液适量，加适量纯水稀释后，采用380 ZLS激光粒度测定仪分别测定粒径及Zeta电位，结果见图5。GB-NP的粒径为（190.4±2.5）nm，PDI为0.19±0.01，其Zeta电位分布在−44.7～−36.5 mV。

2.7  GB-NP包封率与载药量的测定

精密移取3个批次GB-NP溶液3份，采用   12 000 r/min超速离心（4 ℃）10 min后，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液按“2.2.2”项下色谱条件下测定GB的量。根据公式计算包封率与载药量。测定结果见表7。

包封率＝W/W₁

载药量＝W/W₂

W为测得被包封的GB量，W₁为实际投药量，W₂为载药纳米粒总质量

2.8  GB-NP的稳定性

2.8.1  GB-NP溶液稳定性实验  利用本实验优化所得的处方制备GB-NP溶液，对其进行72 h内的稳定性考察，结果此方法制备的GB-NP溶液在72 h内稳定性较好，平均粒径和PDI在72 h没有明显变化，结果见表8。

2.8.2  GB-NP 溶液血浆稳定性实验  GB-NP在37 ℃条件下置于模拟血浆（含10%胎牛血清的TRIS缓冲液）中，24 h内的粒径变化见表9。可见，GB-NP粒径和PDI随时间增加没有明显变化，说明在24 h内GB-NP在模拟血浆中较为稳定。

2.9  GB 纳米粒冻干制剂的研究

2.9.1  冻干工艺的建立  由“2.8.1”项下稳定性考察得到GB-NP溶液在72 h内稳定性较好，但1周后有肉眼可见的EP管内壁有微细的结晶析出，故考虑将纳米溶液进一步进行冻干。根据冷冻干燥的基本原理和预试验结果，确定冷冻干燥工艺为取已制备的GB-NP溶液适量，加入1%的甘露醇，振荡使其溶解，分装入西林瓶，每瓶2 mL，置−80 ℃的超低温冰箱中预冻12 h，然后迅速移入冷冻干燥机中，在−40 ℃、5 kPa（0.05 bar）条件下干燥24 h，取出后压盖密封，即得GB-NP冻干制剂。

2.9.2  冻干前后的变化  按确认的处方和工艺制备的3批GB-NP冻干制剂，肉眼观察均为淡黄色，表面细腻，呈疏松状，振摇后可以整块脱落。

取冻干前GB-NP溶液和冻干后的冻干制剂，分别测定其粒径、Zeta电位、PDI，结果见表10。结果表明，GB-NP冻干前后的平均粒径、PDI以及Zeta电位并无显著性差异。

2.9.3  冻干制剂稳定性考察  将GB-NP冻干制剂在4 ℃下储存，分别于0、3、7、15 d后测定粒径和PDI，测定结果见表11。结果显示，在15 d内GB-NP冻干制剂稳定性较好，可较长时间储存。

2.10  GB和GB-NP的体外释放研究

本实验选用透析法进行体外释药特性研究^[29-30]，设定溶出温度为（37.0±0.5）℃，转速设为100 r/min，含30%乙醇的生理盐水作为释放介质。取适量的GB-NP冻干制剂加生理盐水分散和GB溶液（以释放介质为溶剂，含量与GB-NP相当），精密吸取2 mL置透析袋内，扎紧后置装有释放介质30 mL的密闭容器内，于恒温摇床振荡下进行释放实验。在释放开始后，分别于0.1、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36 h取样1 mL（同时补加等量同温空白介质），经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，计算药物的累积释放率，结果见图6。可见，GB原药在释放介质中释放很快，1 h累积释放率达到（64.74±3.95）%，至6 h时药物已基本释放完全，累积释放率达到（99.83±0.38）%；GB-NP在1 h累积释放率为（36.90±1.41）%，4 h时累积释放率为（67.76±4.05）%，36 h时累积释放率达到（87.76±3.44）%；显示出了明显的缓释特征。

3  讨论

本实验为解决GB溶解度低，体内消除快、以及目前已有注射剂的缺陷等问题，采用一种修饰的多糖聚合物（ZY-010）作为载体。该聚合物是一种可生物降解的新型高分子材料，由1种多糖和1种维生素偶联而成，偶联物中多糖分子和维生素通过连接臂将多糖与维生素分子共价结合。与其他药物递送系统不同的是该给药系统中药物是被物理包埋到聚合物中，而不是通过化学或共价连接^[31]，因此药物释放无需水解形成前药。

目前纳米粒的形成原理还在研究当中，推测形成机制为药物溶于与水互溶的有机溶剂，与溶于水相的聚合物混合后，聚合物如丝线般缠绕在药物周围形成极小的聚合体，再由众多聚合体形成圆球形状纳米颗粒，透射电子显微镜观察也证实了所形成的纳米颗粒为球形。

在体外释放实验中，GB-NP能够将药物释放时间延长数小时。药物的释放是由快速的初始释放（突释）和缓慢的释放2部分组成。GB原药1 h累积释放率达到（64.74±3.95）%，而GB-NP在4 h时累积释放率为（67.76±4.05）%。GB-NP在最开始的1 h内突释可能是由于吸附在纳米粒表面或者靠近纳米粒表面的药物暴露在释放介质中，但GB-NP在4 h后呈现缓慢释放状态。

本实验的主要目的是将GB制备成可静脉注射的纳米制剂，PDI越小则制剂可以相对越稳定。在考察水相聚合物溶液pH值时，虽然pH 5.0时纳米粒的粒径大于pH 4.0和6.0时的粒径，但pH 5.0时纳米粒的PDI最小，且粒径也小于200 nm，可以保证后续的膜（0.22 μm）滤过除菌的进行。因此，本实验的制备工艺中选择了pH 5.0。

总之，GB-NP能较好地解决GB在水溶液中的溶解性能并达到一定的缓释效果，有望通过这种新型的可生物降解多糖聚合物使GB适合于静脉注射。目前GB-NP在大鼠体内的药动学正在进一步研究。

来源：中草药杂志社

参考文献（略） 

来  源：祝露佳，陈礼迎，郑  爽，范露慧，梁伟宗，俞洁佳，熊  阳. 星点设计-效应面法优化银杏内酯B纳米冻干制剂的制备工艺及其体外释放研究 [J]. 中草药, 2019, 50(22):5439-5447.