今天分享一篇发表在Nature上的文章，文章的通讯作者分别是加州大学洛杉矶分校的Yi Tang教授和Kendall N. Houk教授以及中科院上海有机所的Jiahai Zhou研究员。
杂Diels-Alder反应和Alder-ene反应是合成中的经典反应，这些周环反应在自然界中是由酶催化的。而Alder-ene反应作为一种有效的碳-碳键形成方法，尽管被认为参与几个生物过程，但自然界中还没有发现酶催化该反应的生物例子。因此，作者着手研究生物合成中的酶促Alder-Ene反应。
作者基于先前对外消旋吡哆嗪(1)与LePorin 2-吡啶酮生物碱的研究，假设1的乙烯基环己烷核可能是由反应性(E)-或(Z)-醌甲醚(QM)经Alder-ene反应形成。接着作者对QM进行了量子化学的过渡态计算，发现(Z)-QM更倾向于发生Alder-Ene反应，但是(Z)-QM发生杂Diels-Alder反应过渡态TS2的能量还是比发生Alder-Ene反应的TS1低1.9kcal/mol。这暗示着这条反应一定存在着选择性很强的酶。
作者搜索到了产生化合物1的菌株和产生与1相似化合物的fusaricide菌株，并且搜寻了它们的基因组。结果发现它们都编码着一个同源的生物合成基因簇(adx和epi)，分别含有一个聚酮合成酶-非核糖体肽合成酶(adxC/epic)、一个配对烯酰还原酶(adxD/epD)、一个扩环P450(adxA/epIA)、一个可能的N-羟基化P450(adxB/epB)、一个短链脱氢/还原酶(adxG/ePig)和一个可能的O-甲基转移酶(adxI/epi)。此外，这些酶还在一些真菌菌株中保守，如pdx、modx、upi与 hpi。根据作者先前在LePorin生物合成中发现的周环化酶LepI的序列，他们假设AdxI、EpiI、PdxI、ModxI、UpiI和HpiI中预测的OMT折叠酶是潜在的周环化酶。
作者通过实验发现酮(5)经过PdxG与NADPH可被还原为醇(6), 醇(6)脱水生成(E)-和(Z)-QM，接着在AdxI、PdxI或ModxI催化下会主要发生Alder-ene反应得到产物8（少量产物9），而在EpiI、UpiI或HpiI催化下主要发生杂Diels-Alder反应得到产物9（少量产物8）。
为了从机理上深入了解酶催化的Alder-ene反应，作者对apo-PdxI、底物模拟配合物PdxI-5和产物配合物PdxI-8的X-射线晶体结构进行了分析。结构显示，底物醇(6)可能在K337的促进下经历了脱水，口袋构型更利于生成(Z)-QM。K337A突变体在实验中无法脱水也佐证了这一发现。作者继续使用了500ns的分子动力学模拟探究了PdxI对两种反应具有选择性的原因，K337由于能诱导脱水反应而质子化，其侧链被模拟甲基铵。模拟中，H161与吡啶酮的N1形成氢键，K337和H336与C4-羰基形成氢键，K337与后者的氢键保持时间更长，表明质子化的K337可能通过氢键催化促进了Alder-ene反应。于是，作者建立了简化的分子模型通过量子化学TS计算探究H161、K337氢键对反应的影响。发生Alder-ene反应TS-3的总焓垒为9.2kcal/mol，而发生杂Diels-Alder反应的TS-4的总焓垒为12.6kcal/mol，PdxI活性中心通过O4质子化改变了反应的电子态，有利于Alder-ene反应。此外T232还被发现起到空间壁的作用，阻止了别的过渡态生成产物11。
去除K337的计算结果显示杂Diels-Alder反应的TS-6更占优势，表明催化O4-杂Diels-Alder反应的酶(EpiI、HpiI和UpiI)必须避免质子转移到吡啶酮C4羰基上。同样作者解出了apo-HpiI和HpiI-5的晶体结构，发现其中M415的较大侧链会引起K388侧链远离底物，这个MET残基在EpiI、UpiI和HpiI是保守的(分别为M411、M407和M415)。作者将PdxI的V413突变为了M，发现主要反应类型从Alder-ene反转为杂Diels-Alder（产物8：产物9=40：60）；另一方面，EpiI中的M411突变为较小的缬氨酸或半胱氨酸虽然并未反转，但使产物比从5：95改变为25：75。EpiI T231残基突变为较小的丙氨酸或丝氨酸残基后，产物比也显著改善，双突变体EpiI(M411V/T231A)使得其主要反应类型反转为杂Diels-Alder。总之，作者报告了两组催化不同反应的周环化酶，在计算研究的指导下，解释了造成两种反应选择性的原因，并成功设计了逆转反应选择性的突变体。
本文作者：Gu ZH
责任编辑：CY
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-020-2743-5
原文引用：10.1038/s41586-020-2743-5
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